菌种保藏技术进展

菌种保藏技术进展
微生物的生长周期短，能用工业生产，但是人为的不断传代伴随而来的缺陷是容易引起遗传变异。因此，从30年代开始就有菌种保藏的研究报告，并探索出了很多方法。许多国家都已建立了专门的菌种保藏机构，如美国标准菌种收藏所（ATCC）、英国的国立标准菌种收藏所（NCTC）、***大阪发酵研究所（LFO），还有全球性的世界微生物保存联盟（WFCC）。这些机构都出售和交换菌种并出版菌种目录。全世界的菌种保藏机构在300个以上。我国在1979年成立了中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM），制订了组织和管理条件并设立6个保藏中心。菌种保藏的目的明确，在基础研究工作中，同一菌种在工作过程及结束后，均可获得重复的实验结果。对于有经济价值的生产菌，需要保持其高产的性能。通过生物工程技术所得的重组菌必须保持其遗传特性的稳定性。总之在保藏期内，既要随时可以使用这些菌种，又要尽可能减少甚至不产生遗传变异。本文介绍几种菌种保藏的方法。
1． 斜面保藏法
这是一种最基本的方法，适用范围广，细菌、真菌及放线菌都可应用。当微生物在适宜的斜面培养基和温度条件下生长良好后，一般在4℃左右可保藏3~6个月。到期后重新移种一次。当然保藏温度和时间都不是绝对的，个别菌种甚至在37℃保藏为宜，也有的需要1~2周传代一次。这种方法的弊端是传代次数多了容易发生变异，如产生孢子能力下降、发酵能力减弱、毒力减小甚至基因失落等，传代次数多也容易使污染机会增加。目前许多实验室采用密封性能较好的螺旋口试管替代传统的棉塞和减少碳水化合物的含量的方法，更有利于菌种的保藏。
2． 穿刺保藏法
此法是斜面保藏的一种改进方法，常用于保藏各种需气性细菌。方法是将培养基制成软琼脂（琼脂含量为斜面的1/2，一般为1%），盛入1.2×10cm的小试管或螺旋口小试管内，高度为试管的1/3。121℃高压灭菌后不制成斜面，用针形接种针将菌种穿刺接入培养基的1/2处。培养后的微生物在穿刺处及琼脂表面均可生长。然后覆盖以2~3mm的无菌液体石蜡。液体石蜡必须高压灭菌2次。这样的小管可在冰箱中保存以减少微生物的代谢作用。因此保藏效果较斜面为好。如果不用穿刺法而直接将液体石蜡加入生长好的斜面上亦可得到相似的效果，而且适用的范围较广，真菌放线菌都可适用。但发现液体石蜡减少应及时补充。穿刺法及液体石蜡覆盖法都很简便，但保藏期却因微生物种类不同而有很大的差异，真菌有的可保藏达10年之久，对一些形成孢子能力很差的丝状真菌，液体石蜡覆盖法行之有效。而另一些菌种如固氮菌、分支杆菌、沙门氏菌、毛霉等却不适宜。此外，从液体石蜡覆盖层下移种时，接种针在火焰上烧灼时菌体会随着液蜡四溅，如果培养物是病原菌时，应予注意。第一代的培养物会有液蜡的残迹和复壮问题，第二代才适于实验用。
3． 干燥保藏法
这种方法适用于形成芽孢子的细菌、形成孢子的丝状真菌和放线菌。其原理是将微生物吸附在各种载体上，干燥后保藏。一般将园土或耕作土研细、过筛（24筛目），干燥后使用，也可以用沙子过筛后以氢氧化钠和盐酸交替洗净后作为载体。在1.2×10cm小试管内盛入土壤或砂子至1cm高度，121℃高压灭菌2~3次。细菌可加入浓的悬液，真菌和放线菌可直接刮下孢子混和，大体上目测载体稍有湿润即可。小试管放入真空干燥器中或在干燥器中加五氧化二磷作为吸水剂干燥，试管口可熔封亦可用石蜡封口后，仍放在干燥器械内在5℃保藏。其保藏期一般为2年，有些微生物可长达10年之久。室温保藏效果较差。使用时，只需将少量土壤或砂子均匀倾倒在斜面上，生长好后再移种一次供使用。除了用土壤或砂子作为载体外，亦可使用6~12筛目过筛的硅胶、磁珠或多孔玻璃珠、以及曲子和麦粒来代替，硅胶必须是无色的，着色的硅胶指示剂对微生物有毒性，在硅胶中加入菌液时由于生产吸附热，温度会相应增高，接种时要将盛有硅胶的小试管置于水中冷却。砂子及土壤是更为常用的载体。
4． 悬液保藏法
悬液法的基本原理是将微生物悬浮于不含养分的溶液如蒸馏水、0.25M磷酸缓冲液（Ph6.5）或生理盐水中保藏。适用于丝状真菌、酵母型真菌及细菌中的肠道菌科。大部分能保藏1年或更长。此法的关键是要用密封性能好的螺旋口试管或一般试管加橡皮塞以防止水分的蒸发。保藏在4℃、10℃或室温（18~20℃）。目前国内生产厂应用玉米发酵醪在冰箱中保种，接种时即将老的发酵醪接入新鲜玉米醪，经热处理后进行保温培养。
5． 液氮保藏法：液氮罐在目前来说已是实验室较容易购置。用液氮罐来保藏菌种，效果好、方法简单、保藏的对象也最为广泛。其方法是将浓的悬液加入灭菌后的分散剂中，细菌加入最终浓度为10%的甘油或5%二甲基亚砜（DMSO（作为防冻的保护剂灭菌后加入）pH7.6。这种营养明胶可制成良好的细菌悬液，许多细菌可保藏4年之久。此法操作简便但无菌要求较高。
6．梭-氏（Sordelli）[4]真空干燥保藏法：此法的基本原理是将小试管中的菌液，不经过冷冻而直接抽干保藏。=般用0.8×6cm有棉塞的小试管，加入以脱脂牛乳等分散剂制成的细菌悬液。悬液中细菌的浓度应高而加入小试管的数量应少，一般不超过5滴，将小试管振荡使悬液附于管壁，贴上标签后，放入12×150cm的大试管中，大试管底部加入少量五氧化二磷及几粒小玻璃珠使小试管不直接与干燥剂接触。大试管的口上配有中间插有玻璃管的橡皮塞。将真空泵与橡皮管联接，抽真空至0.05托左右。可以用石蜡将橡皮塞和玻璃管全部封住，也可以在橡皮塞下部将大部试管拉细，第二次抽真空熔封。在5℃低温下保藏时，NCTC曾报道保藏了2724个菌种，14年后的存活率为83%。酵母及丝状真菌可保藏数年，但对一些敏感的菌珠不适用。
7．真空干燥保藏法：此法是在较高的真空度下，将液态样品直接减压干燥，常被称为L-干燥保藏法（drying from the liquid state的简称）。对于病毒、噬菌体、有些螺旋体效果胜于冷冻干燥法。细菌和酵母亦能使用。在安瓿管中加入1～2滴微生物悬液，切除管口棉塞并将棉塞部推入安瓿管内以便在棉塞上端将管子拉细。棉塞的松紧是操作的要点。这样的安瓿管直接装在孔管上用真空泵减压干燥，其真空度约至0.1托时表在同基本干燥后，再抽1h即可熔封。样品的温度有的是维持在20℃水浴中，有的装置可使温度降至10℃，但总不会达到冰点。干燥的时间需要10～20h或过夜。这种方法可能因使用不多，保藏期限报道较少。噬菌体的保藏期为5年左右。
8．冷冻干燥保藏法
用这种方法保藏菌种已有几十年的历史，由于它具有保藏期长、变异小、便于大量保藏及适用范围较广等优点，是各保藏机构使用的主要方法。曾有报导ATCC保藏的6,500个菌种中只有不到100个无法用这种方法保藏，病原菌中的98.5%适用。仅有一些不产孢子的丝状真菌不宜用此法。其基本原理是将微生物或孢子冷冻，然后在减压情况下利用升华现象除去水分，使细胞的代谢、生理等生命活动处在停止状态下进行长期保藏。此法可用小箱式或多孔道的冷冻干燥机进行，亦可自制一简单的装置进行。它的操作步骤稍复杂一些，下面将分别叙述。
（1）收集菌种： 作为长期保藏的菌种，应当选择最适培养基和温度以便得到良好的培养物。培养时间要掌握在生长后期，因为对数生长期的细菌对冷冻干燥的抵抗力较弱，有孢子的微生物需适当的培养以期得到成熟的孢子。大致说，细菌是24~48h，酵母为72h，放线菌和丝状真菌是7~8天以上。从理论上说，最好是用生理盐水或缓冲液将斜面上刮下的菌体或孢子洗几次，以期洗净培养基中可能带来的各种物质。但在实际操作中如果洗净的条件不适宜会使细胞受损，同时也增加了污染的可能性，一般都省略了这一步骤。操作时先将少量分散剂（保护剂）加入斜面中，轻轻刮下菌苔或孢子，注意不要划破斜面而带入培养基，也可通过纱布脱脂棉的过滤，制成均匀的悬液。悬液的细胞浓度，因细菌和孢子大小不一，不易订出统一的标准，细菌可保持在109~1010/ml左右，孢子应尽可能分散从而制成20支安瓿管。如果用液体培养，则在离心后除去上清液，每10ml所得的菌体可加入1~2ml的分散剂。这个步骤中必需严格的遵守无菌操作和检验培养的程度，因保藏期较长，培养物不纯或操作污染都会造成不良的后果。制成悬液后即在同样严格的无菌条件下用毛细滴管加入灭菌好的安瓿管中，每个安瓿管装量约为0.1~0.2ml，但不必准确控制，通常加入3~4滴即可。
（2）安瓿管的准备: 冷冻干燥用的安瓿管形状不一，有的是直形小管，有的在底部带球形，有一些病原菌更需要在安瓿管内再装入很小的玻璃套以保证安全。安瓿管的内径为8~10mm，长度不小于100mm。安瓿管的玻璃要求中性、能耐热、耐压、耐温度的骤变和管底厚度均匀，先用毛细滴管加入洗液浸泡过夜，第二天用水及蒸馏水洗净后干燥，瓶口加脱脂棉塞用纸包好，在121℃灭菌30min后，再在60℃烘箱中干燥。干燥温度不宜过高以防止脱脂棉被烤焦。
（3）分散剂 ：分散剂或称保护剂，其作用有二：一是使悬浮液悬浮其中保持活的状态；二是减少冷冻干燥时对微生物引起的损伤。分散剂大致可分为低分子化合物如氨基酸、有机酸、糖类等；高分子化合物如蛋白质、多糖等，原则上是二者配合使用的。ATCC及NRRL用马血清、NCTC用1:3的营养肉汤和马血清加入7.5%的葡萄糖。常用的是脱指牛乳和血清。最简单的是将普通牛乳离心后除去上层乳脂，常压灭菌3次每次1h，温度过高将影响保藏的效果。血清要过滤灭菌，牛乳可加热灭菌且冷冻干燥后易形成均匀粉末故更为常用。
（4）冷冻：装入悬液的安瓿管应立即冷冻，不宜放置过久。时间长了会使用菌体自行沉淀成为不均匀的悬液而不利冷冻，同时还会使分散剂起培养基的作用使微生物再次生长或萌发了孢子，这些情况都不利于长期保藏。冷冻的温度达到-30℃以下即可，有冷冻干燥机的可在冷冻架上进行，否则用一个盛有干冰的广口热水瓶将安瓿管在干冰中转动几下即可。冷冻后的安瓿管应立即真空干燥。
（5）真空干燥：真空干燥可用小箱式的冷冻干燥机，冷冻结束后立即启动真空泵，在15min内使小箱内真空度达到0.5托，1托的真空度约为1mmHg（1mmHg=133.322Pa）以上。随着真空度上升至0.1 托以上，可以升高箱板的温度，使小箱内的温度升至25~30℃。此时由于升华还在继续，样品不会融化而能达到干燥的目的。如果有后干燥装置，可以利用油泵进行后干燥，真空箱内的真空度可达到0.01托以上，干燥效果更好。干燥完毕后关闭真空泵、排气、取出安瓿管将管颈拉细，再装在多孔管道上抽真空和融封。这种装置每次可冷冻干燥大量安瓿管，干燥度和真空度都较高，每次需要的时间较长约在10h以上。
（6）离心式冷冻干燥机：另有一种带离心机的冷冻干燥机，其主要区别是在真空箱内装有一个可插入安瓿管口棉塞，插入预冷至-30℃~-50℃的小箱内离心机上。启动离心机及真空泵，约15min后真空度达0.1托时，样品已被冷冻。此时关闭离心机将样品抽干，如有加温装置，则在关闭离心机后逐步加温至25~30℃使样品加速干燥，这种装置可在数小时内完成全部过程。它的主要优点是在离心作用情况下抽真空，不会产生泡沫而影响冷冻干燥的效果，但是安瓿管数受离心插头号的限制和污染的机会较多，并不常被采用。冷冻干燥的装置还有钟罩式等，其基本原理与操作均相同，不一一列举。
（7）安瓿管的熔封：熔封必须在第二次抽真空情况下，在多孔管道上进行。一般使用二或三个喷嘴的煤气灯并由空气压缩机送入少量氧气。熔封技术需很熟练，因为既要达到熔封完全无任何泄漏，同时又要求外观完整均匀。熔封是在棉塞下部安瓿管已拉细处。
（8）标签：安瓿管的标签应当予以必要的注意，在大量保藏菌种时不允许有任何的差错。可以在灭菌前加入有菌名、日期的小纸片，最简单的是在加悬液前加入有菌名、日期的小条胶布。应当避免用水溶性的笔来写标签。
（9）安瓿管的保藏及影响保藏因素：安瓿管可放在冰箱内在4~5℃低温下保藏。保藏期为5~10年。室温保藏的效果不佳。影响保藏期的因素很多，菌种、菌龄、冷冻干燥过程中各个环节都与之有关。保藏期和菌种变异关，在冷冻干燥中主要是由于干燥样品中含水量的影响。通常含水量在1~3%时较好，5~6%就会相应降低，虽然不一定进行含水量的测定，可用目测或真空度来控制，但应当引起必要的注意，此法保藏的菌种可以长期保藏菌种的稳定，有报道（2）将保藏10年的12个属的细菌进行生理、生化、血清学的测定而没有发生变异，许多生产用的放线菌生理、生化、血清学的测定而没有发生变异，许多生产用的放线菌等微生物菌种亦都采用这种保藏方法达到长期保存的目的。
（10）安瓿管的启封：启封时，在无菌条件下，将溶封口处在火焰上稍加热，立即加上1~2滴无菌蒸馏水或用酒精棉花轻擦一下，使玻璃管产生裂缝，稍予轻击即可断落。加入最适生长的液体培养基少量使管内干燥粉末溶解，即可接种在斜面或液体培养基内，一般亦使用经过复壮的第二代菌种。